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    病毒采样管内保存液的配置及使用方法

    2022-04-19 08:39:42

    ①制作病毒采样管内保存液时先称取142.14gTris置于烧杯,加入750mL蒸馏水,磁力搅拌器搅拌溶解均匀,然后加入盐酸调pH至7.6,定容到1L,配成1mol/L的Tris-HCL(pH7.6)。

    ②称取186.0g乙二胺四乙酸二钠二水合物置于烧杯,加入750mL蒸馏水,然后加入氢氧化钠调pH至7.6,定容到1L,配成0.5mol/L的EDTA。

    ③称取20.0g月桂酰肌氨酸置于烧杯,用蒸馏水缓慢搅拌溶解(泡沫较多),定容至100mL,配置20%的月桂酰肌氨酸溶液。

    ④将90mL蒸馏水、10.6mL1mol/LTris-HCL(pH7.6)、4.2mL0.5mol/L的EDTA、100g异硫酸氰胍置于烧杯中。50℃加热搅拌1h直至完全溶解。

    ⑤待上述溶液完全溶解,再加入21.1mL20%的月桂酰肌氨酸、2.12mL的β-巯基乙醇,搅拌均匀,放于4℃保存(4℃保存较长时间会出现晶体析出,但不影响使用效果,在使用一次性病毒采样管内保存液前加热融化即可)。

    PCR体系中样本浓度与Ct值的线性关系取66.6μLN基因假病毒(初始浓度为1×108copies/mL),用病毒采样管提取RNA,Z终用30μLDEPC水洗脱。取9μL纯化的RNA模板加入终体积为20μL的PCR反应体系。根据换算可知,反应体系中的假病毒终浓度为1×108copies/mL(忽略核酸提取过程中的损失)。将N基因假病毒以10倍梯度稀释,使PCR反应体系中假病毒终浓度梯度如下:1×107、1×106、1×105、1×104及1×103copies/mL,每个梯度做3组平行。反应体系20μL:FastVirus1-StepMasterMix5μL、上下游引物及探针各0.4μL、DEPC水4.8μL以及模板9μL。扩增程序:25℃2min;50℃15min;95℃2min;95℃15sec,60℃45sec,45个循环,在60℃时采集荧光信号。

    病毒采样管.jpg

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